Digital PCR และหลักการตรวจ NIPT

 Digital PCR และหลักการตรวจ NIPT

Digital PCR (dPCR) เป็นเทคนิคที่พัฒนามาจาก Polymerase Chain Reaction (PCR) แบบดั้งเดิม โดยมีความสามารถในการตรวจจับและวัดปริมาณกรดนิวคลีอิก (DNA หรือ RNA) ได้อย่างแม่นยำและละเอียดกว่าการทำ quantitative PCR (qPCR) เทคนิคนี้เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีปริมาณน้อย หรือมีเป้าหมายที่ต้องการวัดอยู่ในระดับต่ำมาก หนึ่งในการประยุกต์ใช้ที่สำคัญของ dPCR คือการตรวจคัดกรองความผิดปกติของทารกในครรภ์แบบไม่รุกล้ำ หรือ Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT)

หลักการทำงานของ Digital PCR

Digital PCR มีหลักการทำงานโดยการแบ่งตัวอย่าง DNA หรือ cDNA ออกเป็นจำนวนมากของไมโครรีแอคชัน (microreaction) หรือดรอปเล็ต (droplet) แต่ละรีแอคชันจะทำปฏิกิริยา PCR แยกจากกันเป็นอิสระ และมีเพียง DNA เป้าหมายเดียวในแต่ละรีแอคชัน ผลลัพธ์จะถูกวิเคราะห์แบบไบนารี (Binary Analysis) คือ มีสัญญาณ (positive) หรือไม่มีสัญญาณ (negative) จากนั้นใช้สถิติ Poisson ในการคำนวณปริมาณของ DNA เป้าหมายที่แท้จริง

หลักการตรวจ NIPT ด้วย Digital PCR

NIPT อาศัยการตรวจสอบเซลล์ฟรี DNA (cfDNA) ที่อยู่ในกระแสเลือดของมารดา โดย cfDNA ประกอบด้วย DNA จากทั้งมารดาและทารก ซึ่งสามารถแยกออกจากกันได้โดยวิธีทางชีวสารสนเทศหรือการวิเคราะห์อัตราส่วนของโครโมโซมเป้าหมาย เทคโนโลยี dPCR ช่วยให้สามารถตรวจจับความผิดปกติของโครโมโซม เช่น ไตรโซมี 13, 18 และ 21 ได้อย่างแม่นยำ

ขั้นตอนการตรวจ NIPT ด้วย Digital PCR

1. เก็บตัวอย่างเลือดมารดา

   • ใช้หลอดเก็บเลือดเฉพาะที่ป้องกันการเสื่อมสลายของ cfDNA

   • แยกพลาสมาออกจากเซลล์เม็ดเลือดโดยการปั่นเหวี่ยงความเร็วสูง

2. สกัด cfDNA

   • ใช้ชุดสกัด DNA ที่ออกแบบมาสำหรับ cfDNA โดยเฉพาะ เพื่อให้ได้ DNA ที่บริสุทธิ์และสมบูรณ์

3. แบ่ง cfDNA ออกเป็นไมโครรีแอคชัน

   • cfDNA ที่สกัดได้จะถูกนำไปแบ่งออกเป็นไมโครรีแอคชันขนาดเล็ก (ดรอปเล็ตหรือช่องไมโครฟลูอิดิกส์)

4. ทำ PCR แบบดิจิทัล

   • เพิ่มสารทำปฏิกิริยา PCR พร้อมโพรบที่จับกับโครโมโซมที่ต้องการตรวจสอบ เช่น โครโมโซม 13, 18, และ 21

   • ขยาย DNA โดยใช้เทอร์โมไซเคลเลอร์ที่เหมาะสมกับ dPCR

5. วิเคราะห์ผล

   • อ่านผลลัพธ์ด้วยเครื่องอ่านสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์

   • วิเคราะห์จำนวนไมโครรีแอคชันที่ให้สัญญาณบวกและลบ

   • ใช้สถิติ Poisson ในการคำนวณอัตราส่วนของโครโมโซมเป้าหมาย เปรียบเทียบกับค่าปกติเพื่อตรวจหาความผิดปกติ

ข้อดีของการใช้ Digital PCR ในการตรวจ NIPT

• ความแม่นยำสูง: สามารถตรวจพบการเพิ่มขึ้นของโครโมโซมเป้าหมายเพียงเล็กน้อยได้อย่างชัดเจน

• ความไวสูง: ตรวจจับ DNA ของทารกที่มีปริมาณน้อยได้ดี

• ลดอัตราผลบวกลวง: มีโอกาสเกิดข้อผิดพลาดจากตัวอย่างปนเปื้อนหรือความแปรปรวนทางเทคนิคต่ำ

• สามารถวิเคราะห์เฉพาะเจาะจงได้: สามารถออกแบบโพรบเพื่อจับกับยีนหรือบริเวณที่ต้องการตรวจสอบโดยเฉพาะ

การประยุกต์ใช้ Digital PCR ใน NIPT

1. การตรวจคัดกรองไตรโซมี

   • ตรวจจับภาวะไตรโซมีของโครโมโซม 13, 18 และ 21 ซึ่งเป็นสาเหตุของกลุ่มอาการ Patau, Edwards และ Down ตามลำดับ

2. การตรวจโรคทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับการกลายพันธุ์แบบจุด

   • สามารถใช้ dPCR เพื่อตรวจหาโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากการกลายพันธุ์ของยีนเดี่ยว เช่น เบต้าธาลัสซีเมีย หรือโรคฮีโมฟีเลีย

3. การตรวจเพศของทารก

   • ตรวจหาโครโมโซม Y ใน cfDNA ของมารดาเพื่อตรวจเพศของทารก

4. การวิเคราะห์โมเสกิซึม (Mosaicism) ในทารก

   • Digital PCR สามารถตรวจพบเซลล์ที่มีจำนวนโครโมโซมผิดปกติบางส่วน ซึ่งอาจบ่งชี้ถึงภาวะโมเสกิซึม

สรุป

Digital PCR เป็นเทคนิคที่มีความแม่นยำสูงและเหมาะสมสำหรับการตรวจ NIPT เนื่องจากสามารถตรวจวัดปริมาณ cfDNA ได้อย่างละเอียด และช่วยลดข้อผิดพลาดที่เกิดจากปัจจัยรบกวนต่าง ๆ การใช้ dPCR ใน NIPT สามารถช่วยเพิ่มความแม่นยำในการตรวจคัดกรองความผิดปกติของทารกในครรภ์ และช่วยให้แพทย์สามารถให้คำแนะนำแก่ผู้ป่วยได้อย่างถูกต้องและรวดเร็ว