หลักการตรวจวิเคราะห์ของ NIPT ด้วย NGS

หลักการตรวจวิเคราะห์ของ NIPT ด้วย NGS

การตรวจคัดกรองความผิดปกติของโครโมโซมก่อนคลอดโดยใช้เทคโนโลยีการตรวจหาดีเอ็นเอของทารกจากเลือดมารดา หรือที่เรียกว่า Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT) เป็นเทคนิคที่ทันสมัยและมีความแม่นยำสูง NIPT อาศัยเทคโนโลยี Next-Generation Sequencing (NGS) ในการตรวจวิเคราะห์ความผิดปกติของโครโมโซมของทารกจาก cell-free fetal DNA (cffDNA) ที่อยู่ในกระแสเลือดของมารดา

หลักการของ NIPT ด้วย NGS

1. การเก็บตัวอย่างและเตรียมดีเอ็นเอ

ตัวอย่างเลือดของมารดาจะถูกเก็บในหลอดเฉพาะที่ช่วยรักษาคุณภาพของ cffDNA หลังจากนั้นเลือดจะถูกปั่นแยกพลาสมาออกมา และทำการสกัด cell-free DNA (cfDNA) ซึ่งเป็นส่วนผสมระหว่างดีเอ็นเอของมารดาและทารก

การแยก cfDNA ของมารดาและทารกออกจากกัน

• cfDNA ของทารก (cffDNA) มักจะมีขนาดสั้นกว่า cfDNA ของมารดา โดยทั่วไป cffDNA มีขนาดประมาณ 140-160 bp ในขณะที่ cfDNA ของมารดาจะมีขนาดใหญ่กว่า (มากกว่า 160 bp)

• สามารถใช้เทคนิค Size Selection เพื่อเลือกเฉพาะชิ้นดีเอ็นเอที่มีขนาดสั้นเพื่อเพิ่มความแม่นยำของการตรวจ

• นอกจากนี้ ยังสามารถใช้วิธีการคำนวณสัดส่วนของ cfDNA โดยเปรียบเทียบลำดับเบสที่มีลักษณะเฉพาะของโครโมโซมของทารก ซึ่งแตกต่างจากของมารดา

2. การเตรียมห้องสมุดดีเอ็นเอ (Library Preparation)

ดีเอ็นเอที่สกัดได้จะถูกนำมาเตรียมห้องสมุดโดยกระบวนการที่รวมถึง:

• การตัดดีเอ็นเอให้มีขนาดที่เหมาะสม

• การเติมส่วนท้ายของดีเอ็นเอด้วย adapters และ barcodes เพื่อให้สามารถนำไปวิเคราะห์ด้วย NGS

3. การหาลำดับดีเอ็นเอด้วย NGS

NGS เป็นเทคนิคที่สามารถอ่านลำดับดีเอ็นเอจำนวนมากได้ในเวลาเดียวกัน โดยทั่วไป NIPT จะใช้ whole genome sequencing (WGS) หรือ targeted sequencing ขึ้นอยู่กับแพลตฟอร์มที่ใช้ โดยกระบวนการมีดังนี้:

1. การสร้างคลัสเตอร์ของดีเอ็นเอ บน flow cell

2. การหาลำดับเบส โดยใช้หลักการของ sequencing-by-synthesis

3. การตรวจสอบคุณภาพของข้อมูลที่ได้

4. การวิเคราะห์ข้อมูลทางชีวสารสนเทศ

ข้อมูลลำดับดีเอ็นเอที่ได้จะถูกนำมาวิเคราะห์ด้วยอัลกอริธึมเฉพาะเพื่อประเมินปริมาณของแต่ละโครโมโซมใน cfDNA โดยเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลอ้างอิง หากพบว่าปริมาณของโครโมโซมใดผิดปกติ เช่น โครโมโซม 21 มีปริมาณเพิ่มขึ้น อาจบ่งชี้ถึงภาวะดาวน์ซินโดรม (Trisomy 21) นอกจากนี้ ยังสามารถตรวจพบ Trisomy 18 (Edward syndrome), Trisomy 13 (Patau syndrome) และความผิดปกติของโครโมโซมเพศได้

หลักการที่ใช้ในการตรวจเฉพาะโครโมโซม 13, 18, และ 21

• การใช้ shotgun sequencing ทำให้สามารถวิเคราะห์ปริมาณ cfDNA ที่มาจากแต่ละโครโมโซมได้

• การคำนวณอัตราส่วนของลำดับเบสที่มาจากโครโมโซมเป้าหมาย (เช่น chr13, chr18, chr21) เทียบกับโครโมโซมอ้างอิง

• หากพบว่าปริมาณดีเอ็นเอจากโครโมโซมเหล่านี้สูงกว่าปกติ อาจเป็นสัญญาณของ Trisomy

• เทคนิค targeted sequencing สามารถใช้ probe ที่ออกแบบมาเพื่อจับกับเฉพาะโครโมโซมที่ต้องการตรวจ เพื่อเพิ่มความแม่นยำของการวิเคราะห์

5. การแปลผลและการรายงานผล

ผลการวิเคราะห์จะถูกรายงานในรูปแบบของค่าความเสี่ยง เช่น z-score หรือ fetal fraction โดยต้องพิจารณาถึงข้อจำกัดต่าง ๆ เช่น อัตราส่วนของ fetal fraction ในตัวอย่างเลือดมารดา หากต่ำกว่า 4% อาจทำให้การตรวจวิเคราะห์มีความแม่นยำน้อยลง นอกจากนี้ยังต้องอาศัยการยืนยันผลด้วยวิธีอื่น เช่น Amniocentesis หรือ CVS หากผลตรวจบ่งชี้ความผิดปกติ

ข้อดีและข้อจำกัดของ NIPT ด้วย NGS

ข้อดี:

• มีความแม่นยำสูง โดยเฉพาะในกรณีของ Trisomy 21

• เป็นการตรวจที่ไม่รุกล้ำ ปลอดภัยต่อมารดาและทารก

• สามารถตรวจได้ตั้งแต่อายุครรภ์ 10 สัปดาห์ขึ้นไป

ข้อจำกัด:

• อาจให้ผลบวกลวงหรือผลลบลวงในบางกรณี เช่น กรณีของ vanishing twin

• ไม่สามารถตรวจหาความผิดปกติของโครงสร้างโครโมโซมได้ละเอียดเท่ากับการทำ karyotyping หรือ chromosomal microarray

• ค่าใช้จ่ายสูงกว่าการตรวจคัดกรองแบบเดิม

สรุป

NIPT ที่ใช้ NGS เป็นเทคนิคที่ช่วยให้สามารถตรวจคัดกรองความผิดปกติของโครโมโซมของทารกได้อย่างแม่นยำและปลอดภัย โดยอาศัยการวิเคราะห์ cfDNA จากเลือดมารดา แม้ว่าจะมีข้อจำกัดบางประการ แต่ถือเป็นหนึ่งในวิธีการตรวจที่มีศักยภาพสูงและได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางในปัจจุบัน