หลักการ Nanopore sequencing เครื่องวิเคราะห์ลำดับสารพันธุกรรมสายยาว

ความเป็นมาของ Nanopore sequencing

Nanopore sequencing เป็นเทคโนโลยีการถอดรหัสลำดับ DNA และ RNA ที่พัฒนาขึ้นในช่วงปี 1980 โดยมีการค้นพบโปรตีนที่ทำหน้าที่เป็นช่องเล็กๆ (nanopore) ที่สามารถตรวจจับประจุไอออนจากกรดนิวคลีอิกได้. เทคโนโลยีนี้ได้รับการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง จนกระทั่ง Oxford Nanopore Technologies (ONT) ได้เปิดตัวอุปกรณ์ที่สามารถใช้งานได้ง่ายและสะดวกในปี 2018 ซึ่งสามารถทำการถอดรหัสพันธุกรรมได้ทุกที่

https://www.nature.com/articles/s41587-021-01108-x

หลักการและทฤษฏี

หลักการทำงานของ nanopore sequencing คือ การใช้กระแสไฟฟ้าผ่านรูขนาดเล็กของโปรตีนที่เรียกว่า nanopore เพื่อให้โมเลกุลกรดนิวคลีอิก (DNA หรือ RNA) ผ่านเข้าไปในรูนี้ เมื่อโมเลกุลเหล่านี้เคลื่อนที่ผ่าน nanopore จะเกิดการเปลี่ยนแปลงของกระแสไฟฟ้าที่สามารถวัดได้ ซึ่งจะถูกแปลงเป็นลำดับเบสของ nucleotides. การใช้ motor protein ช่วยในการควบคุมการเคลื่อนที่ของ DNA หรือ RNA ทำให้สามารถอ่านลำดับเบสได้อย่างแม่นยำและรวดเร็ว โดยมีความเร็วในการอ่านประมาณ 450 เบสต่อวินาที

กระบวนการวิเคราะห์

กระบวนการวิเคราะห์ข้อมูลจาก nanopore sequencing ประกอบด้วยขั้นตอนการจัดกลุ่มและเชื่อมต่อข้อมูลลำดับเบสที่อ่านได้เพื่อสร้าง isoform gene หรือ reference genome แม้ว่าความถูกต้องของข้อมูลจะมีการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง แต่ก็ยังมีอัตราความผิดพลาดที่สูงเมื่อเปรียบเทียบกับเทคโนโลยีการหาลำดับแบบอื่น ๆ เช่น next-generation sequencing (NGS)

การประยุกต์

Nanopore sequencing มีการประยุกต์ใช้ในหลายด้าน เช่น การศึกษา genome, transcriptome, epigenome และ epitranscriptome นอกจากนี้ยังใช้ในการ assembly ของ genome, การตรวจจับ full-length transcript และ base modification detection. เทคโนโลยีนี้เหมาะสำหรับงานวิจัยที่ต้องการข้อมูลลำดับเบสที่มีความยาวและแม่นยำสูง

จุดเด่น จุดด้อย

จุดเด่น:

• สามารถอ่านลำดับ DNA และ RNA ได้อย่างต่อเนื่องโดยไม่ต้องใช้ PCR

• มีความเร็วในการอ่านสูงและค่าใช้จ่ายต่ำเมื่อเปรียบเทียบกับเทคโนโลยีอื่น ๆ

• สามารถใช้งานได้ในสถานที่ต่าง ๆ เนื่องจากอุปกรณ์มีขนาดเล็กและพกพาได้

จุดด้อย:

• อัตราความผิดพลาดในการอ่านยังสูงเมื่อเปรียบเทียบกับ NGS

• ข้อมูลที่ได้อาจต้องผ่านกระบวนการปรับค่าให้ถูกต้องก่อนนำไปวิเคราะห์เพิ่มเติม.

ตารางสรุปเกี่ยวกับ Nanopore Sequencing

หัวข้อ	รายละเอียด
หลักการทำงาน	ใช้เอนไซม์หรือมอเลกุลช่วยดึง DNA หรือ RNA ผ่านรูนาโน (nanopore) และวัดการเปลี่ยนแปลงของกระแสไฟฟ้าเพื่อระบุเบส
เทคโนโลยีหลัก	ใช้ biological nanopores (เช่น α-hemolysin, MspA) หรือ solid-state nanopores
ผู้พัฒนา	Oxford Nanopore Technologies (ONT) เป็นบริษัทหลักที่พัฒนาเทคโนโลยีนี้
ข้อดี	อ่านลำดับ DNA/RNA ได้แบบ real-time, อ่านสายยาวได้ (long-read sequencing), ตรวจจับโมดิฟิเคชันของเบส เช่น เมทิลเลชันได้โดยตรง
ข้อจำกัด	อัตราความผิดพลาดสูงกว่าการอ่านสั้น (short-read sequencing), ต้องการการประมวลผลข้อมูลที่ซับซ้อน
แอปพลิเคชัน	WGS (whole genome sequencing), RNA-seq, epigenetics, metagenomics, clinical diagnostics
อุปกรณ์หลัก	MinION (พกพาได้), GridION (ประสิทธิภาพสูง), PromethION (ปริมาณงานสูง)
ไฟล์ข้อมูล	FAST5 (raw data), FASTQ (processed reads), BAM/CRAM (alignment)
เปรียบเทียบกับ Illumina	ความแม่นยำต่ำกว่าแต่สามารถอ่านสาย DNA/RNA ยาวกว่าได้

อนาคต

อนาคตของ nanopore sequencing มีแนวโน้มที่จะเติบโตขึ้น โดยเฉพาะในด้านความถูกต้องและประสิทธิภาพในการอ่านข้อมูล โดยมีการวิจัยและพัฒนาเทคโนโลยีใหม่ๆ ที่จะช่วยลดอัตราความผิดพลาดและเพิ่มความแม่นยำในการวิเคราะห์. นอกจากนี้ ความสามารถในการใช้งานภายนอกห้องปฏิบัติการจะทำให้เทคโนโลยีนี้เข้าถึงได้มากขึ้นสำหรับนักวิจัยและแพทย์ทั่วโลก