เปรียบเทียบเทคโนโลยี Sequencing ทั้ง 3 Generation: ความแตกต่างและการทำงาน

เปรียบเทียบเทคโนโลยี Sequencing ทั้ง 3 Generation: ความแตกต่างและการทำงาน

• Jennifer Ronholm et,al. 2016

ปัจจุบันนี้การวิเคราะห์ลำดับสารพันธุกรรม (Sequencing) ได้พัฒนาไปอย่างมากตั้งแต่อดีตจนถึงปัจจุบัน โดยเราสามารถแบ่งเทคโนโลยีการวิเคราะห์ลำดับสารพันธุกรรมได้เป็น 3 เจเนอเรชันหลัก ๆ ซึ่งแต่ละเจนก็จะมีจุดเด่นและข้อจำกัดที่เหมาะสมแตกต่างกันออกไปครับ การที่เราซึ่งเป็นผู้ใช้หรือผู้รับบริการจากเทคโนโลยีเหล่านี้เข้าใจจุดเด่นและข้อจำกัดของเทคโนโลยีจะช่วยให้สามารถเลือกใช้เทคนิคที่เหมาะสมกับวัตถุประสงค์หรือการประยุกต์ใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นครับ วันนี้เราจะมาทำความรู้จักเทคนิคการวิเคราะห์ลำดับสารพันธุกรรม (Sequencing) กันครับ

Gen 1: Sanger Sequencing

หลักการทำงานของ Sanger Sequencing ใช้กระบวนการที่เรียกว่า “Dideoxy Chain Termination” ซึ่งประกอบด้วยขั้นการขยายสาย DNA โดยใช้เอนไซม์ DNA polymerase และการใส่ dideoxynucleotide (ddNTPs) ที่ทำให้หยุดการขยายสาย DNA ที่ตำแหน่งที่มีการใส่ ddNTPs เข้ามา จากนั้น DNA ที่ได้จะถูกแยกตามขนาดด้วยกระบวนการ Electrophoresis โดยในระบบ capillary electrophoresis จะใช้เลเซอร์ในการกระตุ้นสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของ ddNTP ที่ติดฉลากเพื่ออ่านลำดับเบสของพันธุกรรม

จุดเด่น

• ความแม่นยำสูงมาก (Error rate ต่ำกว่า 0.001%)

• เหมาะสำหรับการวิเคราะห์ลำดับ DNA ที่ไม่ซับซ้อน เช่น ลำดับยีนเดี่ยว

ข้อจำกัด

• วิเคราะห์ได้ทีละตัวอย่างเท่านั้น

• ใช้เวลาและต้นทุนสูงเมื่อเปรียบเทีบกับการวิเคราะห์ทั้งจีโนม

Gen 2: Next-Generation Sequencing (NGS)

หลักการทำงานของ NGS ใช้กระบวนการ “Massively Parallel Sequencing” โดยตัวอย่าง DNA จะถูกหั่นเป็นชิ้นเล็ก ๆ (Fragmentation) และเพิ่ม adapters ที่ปลาย DNA เพื่อยึดติดกับแพลตฟอร์ม จากนั้น DNA จะถูกเพิ่มจำนวน (Amplification) บนพื้นผิวแข็ง เช่น Flow Cell หรือ Beads ขึ้นอยู่กับแพลตฟอร์มที่ใช้ เช่น Illumina หรือ Ion Torrent กระบวนการอ่านลำดับใช้เทคนิคต่าง ๆ เช่น:

1. Illumina: ใช้ Reversible Terminators ซึ่งเป็นเบสที่ติดฉลากฟลูออเรสเซนต์เพื่อให้สามารถตรวจจับทีละรอบ (Cycle)

2. Ion Torrent: ตรวจจับการเปลี่ยนแปลงค่า pH ที่เกิดจากการปล่อยไฮโดรเจนไอออนในกระบวนการขยายตัว

จุดเด่น

• สามารถวิเคราะห์ลำดับได้หลายพันล้านชิ้นพร้อมกัน

• ค่าใช้จ่ายต่อฐานต่ำและประสิทธิภาพสูงสำหรับการวิเคราะห์จีโนมทั้งหมด

ข้อจำกัด

• ความยาวของลำดับที่อ่านได้จำกัด (~50-300 bp)

• ต้องการทรัพยากรในการประมวลผลข้อมูลจำนวนมาก

Gen 3: Third-Generation Sequencing (TGS)

หลักการทำงาน TGS พัฒนาขึ้นเพื่อแก้ไขข้อจำกัดของ NGS โดยการอ่านลำดับ DNA สายยาวแบบ Real-Time โดยไม่ต้องขยาย DNA (PCR-Free) ตัวอย่างเทคโนโลยีสำคัญได้แก่:

1. Pacific Biosciences (PacBio): ใช้ Single Molecule, Real-Time (SMRT) Sequencing ซึ่งวิเคราะห์ลำดับโดยใช้เอนไซม์ DNA polymerase ในการสังเคราะห์ DNA และตรวจจับสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่ปล่อยออกมาในแต่ละเบสแบบ Real-Time

2. Oxford Nanopore Technologies: ใช้ Nanopore ที่สามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงกระแสไฟฟ้าขณะสาย DNA ผ่านรูนาโน โดยการเปลี่ยนแปลงนี้สัมพันธ์กับลำดับเบส

จุดเด่น

• สามารถอ่าน DNA สายยาวได้ (>10,000 bp หรือมากกว่า)

• ตรวจจับการดัดแปลงทางเคมีของ DNA เช่น เมทิลเลชันได้

• ลดความซับซ้อนในกระบวนการเตรียมตัวอย่าง

ข้อจำกัด

• ความแม่นยำต่ำกว่า NGS (Error rate ประมาณ 5-15%) แต่สามารถปรับปรุงได้ด้วยการอ่านซ้ำ

• เครื่องมือมีราคาสูงและอาจต้องการการบำรุงรักษาเฉพาะ

ตารางเปรียบเทียบ Sequencing ทั้ง 3 Generation

คุณสมบัติ	Sanger Sequencing	Next-Generation Sequencing (NGS)	Third-Generation Sequencing (TGS)
หลักการทำงาน	Dideoxy Chain Termination	Massively Parallel Sequencing	Real-Time Single Molecule Sequencing
ความยาวลำดับที่อ่านได้	500-1,000 bp	50-300 bp	>10,000 bp
ความแม่นยำ	สูงมาก (Error <0.001%)	สูง (Error ~0.1-1%)	ปานกลางถึงสูง (Error ~5-15%)
ปริมาณข้อมูลที่ได้	น้อย	สูง	สูง
ค่าใช้จ่ายต่อเบส	สูง	ต่ำ	ปานกลาง
ความซับซ้อนของกระบวนการ	ต่ำ	ปานกลาง	ต่ำ
การใช้งานที่เหมาะสม	งานวิเคราะห์ลำดับสั้นๆ	งานที่ต้องการข้อมูลจำนวนมาก	งานที่ต้องการ Long-Reads หรือ Epigenetics

บทสรุป แต่ละเจเนอเรชันของเทคโนโลยี Sequencing มีจุดเด่นและข้อจำกัดที่เหมาะสมกับงานประเภทต่าง ๆ กันครับ การเลือกใช้เทคโนโลยีขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ เช่น การตรวจสอบลำดับ DNA สั้น (Sanger Sequencing) การวิเคราะห์ข้อมูลจำนวนมากอย่างรวดเร็ว (NGS) หรือการศึกษาสายยาวและการดัดแปลงทางเคมีของ DNA (TGS) การพัฒนาของเทคโนโลยีเหล่านี้ยังคงดำเนินต่อไปเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพและลดต้นทุนในอนาคต




แหล่งอ้างอิงภาพ
https://www.researchgate.net/publication/305904423_Navigating_Microbiological_Food_Safety_in_the_Era_of_Whole-Genome_Sequencing

#Sequencing #การวิเคราะห์ลำดับสารพันธุกรรม